| HAZAI MŰSZERÚJDONSÁGOK |
A GENEBOOSTER™ a génbevitel korszerű eszköze növényekben és állatokban
Napjaink legígéretesebb géntranszformációs eljárása az ún. „génbelövéses transzformáció”. Ezt az eljárást először az Amerikai Egyesült Államokbeli Cornell Egyetemen John Sanford és kutatócsoportja alkalmazta. Az általuk használt eszközt nevezték el „génpuskának”. A módszer lényege: a sejtekbe bejuttatni kívánt DNS molekulákat (amelyek valamilyen számunkra fontos gént kódolnak) 0,5...2 µm átmérőjű wolfrám szemcsék felületére rögzítik majd egy vaktöltény segítségével a szó szoros értelmében belövik a növényi szövetbe (1. ábra). A wolfrám részecske biztosítja a behatolást a merev, kemény sejtfalon keresztül, majd arról a nukleinsav leválik és mind tranziens, mind pedig integratív módon működik a sejtben. Az első kísérletek során kiderült, hogy a „génpuska” nagy hatásfokkal transzformálta a növényi szöveteket, amelyekből intakt transz-génikus növényeket neveltek fel.
1988-90-ben OMFB támogatással (OMFB-FBI 13268 sz.) a gödöllői MBK-ban elkészült az első hazai génbelövő készülék. Az OMFB 91-97-16-0113 számú pályázati szerződés keretében 1991-92-ben megtörtént a génbelövő készülék bemérése és ezután alkalmazásával megkezdődött az egyszikű növények közül a rizsbe és a búzába történő génbevitel. A kísérletek eredményeképpen megszülettek az első hazai transzgénikus rizsnövények. A módszer alkalmasnak bizonyult rizsben stabil génbevitelre és búzában tranziens génexpresszió kiváltására.
Az eltelt évek alatt, használat közben egyre több tapasztalatot szereztünk a génbelövés technológiájáról és arról, hogy miféle átalakításokkal tehetnénk a belövő készüléket még könnyebben kezelhetővé, hatékonyabbá és biztonságosabbá, ami lehetővé teszi a berendezés felhasználását oktatási cékokra is, valamint alkalmassá teszi sorozatgyártásra. Így jött létre az 1994 és 1996 közötti fejlesztés eredményeként az ún. 3. generációs génbelövő készülék, a GENEBOOSTER™, amelyet a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont szabadalmaztatott, a GENEBOOSTER név levédésével együtt.
Közismert dolog, hogy a növényi génszbályozás tanulmányozásának legkézenfekvőbb módja a kérdéses génnel történő transzformáció és ezt követően a transzgénikus növényekben, ezek utódaiban a génexpresszió, hasadás stb. vizsgálata. Ez a séma egészen a közelmúltig nem volt alkalmazható az úgynevezett szövettanilag recalcitráns növényfajok egyik nagy csoportjában, az egyszikű gabonafélékben, a megfelelő transzformációs rendszer hiánya miatt.
A természetben az Agrobacterium tumefaciens a sebzési felületen képes megfertőzni a legtöbb kétszikű fajt (mint pl. dohány, paradicsom, petúnia). 1983-ban megszületett az első transzgénikus növény, miután dohány sejteket olyan Agrobacterium-Ti plasmid rendszerrel inkubáltak, amelynél szelektálható markergén volt beépítve a Ti plasmidba (áttekintésre lásd Jenes et al., 1991). Ezen siker után számos kisérletet végeztek, amelyeknél különböző géneket kapcsoltak a Ti plasmidhoz, ezzel transzformálva dohány levél korongot, és tanulmányozták a génexpressziót a kapott transz-génikus dohánynövényekben (áttekintésre lásd Kuhlemeier et al., 1987). A legtöbb egyszikű faj nem fogékony az Agrobacterium fertőzésre. Ez erősen korlátozza a Ti plasmid transzformációs vektorként történő alkalmazását egyszikűeknél, különösen a Graminea család olyan fontos fajainál mint a búza, rizs és kukorica.
Az elmúlt évtizedben számos, egyszikűekre alkalmazható alternatív transzformációs módszer jött létre. Az új módszerek közé tartozik a polyethylen-glykol-os (PEG) protoplaszt transz-formáció és az elektroporációs módszer (áttekintésre lásd Jenes et al., 1991). Azonban megmaradt a fő probléma, a protoplasztból történő növényregeneráció megoldása. Számos potenciálisan alkalmazható módszert fejlesztettek ki intakt sejtek vagy szervek transzformációjára, igy kerülve meg azokat a gondokat amelyek a protoplasztból történő növényregenerációhoz kapcsolódtak. E módszerek sorába tartozik a DNS ovulumba (magrügybe) történő injektálása, az ún. pollen-tömlő módszer és a „biolistic” (génbelövő) módszer (áttekintésre lásd Jenes et al., 1991).
A génbelövéses módszer a növényekbe történő génbevitel egyik legújabb megközelítése. A „génbelövés" kifejezés a módszer lényegére utal, miszerint a DNS élő sejtekbe, szövetekbe történő bejuttatása egy „génbelövő” készülékkel („génpuskával”) történik. A szakirodalomban ismertetett (Klein et al., 1987) módszer részleteire már az előző részben utaltunk. Az eljárás lényege, hogy a DNS molekulákat hordozó mikrolövedékeket nagy sebességre gyorsítják fel, így a részecskék áthatolnak a sejtfalon és sejtmembránon, magukkal szállítva a sejtek belsejébe az idegen DNS molekulákat.
A GENEBOOSTER™ készülék is ezen elvek alapján működik. Itt is wolfrám szemcsék biztosítják a behatolást a sejtbe a sejtfalon keresztül. Ezt követően a nukleinsavak elválnak a fémszemcsékről és időlegesen aktiválódnak vagy a gazdasejt genomjába integrálódnak. A 2. ábra szemlélteti a GENEBOOSTER™ génbelövő rendszer sematikus vázlatát.
A jelenleg kereskedelmi forgalomban hozzáférhető hasonló rendeltetésű eszközök nagy nyomású, nagy tisztaságú és drága Hélium gázt vagy elektromos kisülést alkalmaznak a mikrolövedékek felgyorsítására. Ezt a hátrányt felismerve, az ELAK Bt.-vel együttműködve, egy továbbfejlesztett készüléket hoztunk létre, amely a legolcsóbb, nagy nyomású, ún. ipari nitrogén gázt használja a részecskék gyorsítására. A kényelmes használat érdekében a szabályozó egységet különválasztottuk a vákumkamrától, így a lamináris steril fülkében több helyünk marad a munkára (3. ábra). A lövés teljes folyamatát egy automatizált mikroprocesszoros vezérlőegység irányítja. A lövési energiát a sejtfal vastagságának és szilárdságának megfelelően állíthatjuk be a szabályozó egységen. Az összes beállítási lehetőségeket (vákuum értéke, lövési nyomás értéke, célszövettartó polc helyzete, acélháló tartó polc helyzete, készülék üzemmódja stb.) valamint a célszövet nevét, a bevinni kívánt plazmidkonstrukció nevét, a DNS rögzítési módszerét és egyéb megjegyzéseket a készülékhez opcio-nálisan csatlakoztatható számítógépben egy egyszerű, Windows 3.1 vagy magasabb verzió alatt futó szoftverrel rögzíteni lehet. Ezt a szoftvert a készülékkel együtt szállítják.
A GENEBOOSTER™ első alkalmazásával sikeresen állítottak elő transzgénikus rizs növényeket (Jenes et al., 1996; Jenes et al., 1997; Vibók et al., 1999, ) majd egyéb fajokban is alkalmazták (Öktem et al., 1999). Az eljárás és készülék alkalmas különböző funkcionális genetikai szabályozó elemek vizsgálatára tranzi-ens génexpresszió kiváltásával (McElroy et al., 1991) számos egymástól távol eső fajban is, mint pl. növényekben (levél, hypocotyl, embrio, scutellum, kallusz, sziklevél stb.) és állatokban is (egér és marha zigóta, halikra, sertés vese szövettenyészet, afrikai zöld majom vese szövettenyészet stb.). A GENEBOOSTER™-t sikerrel alkalmazták Azotobacter fajok és magasabbrendű növények közötti szimbiózis létrehozására is (Preininger et al, 1996; Preininger et al., 1997).
A GENEBOOSTER™ készüléknek a többi jelenleg kapható génbelövő készülékkel szemben a következő előnyei vannak:
DR. JENES BARNABÁS
A laprendszer készítője: UFE Bt.